引用本文： 杨婷, 金松, 刘彦东. 糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞原代培养方法的改良. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(2): 173-176. doi: 10.7507/1007-9424.20140040 复制
近几年糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐渐增加，引起了血管外科医生对糖尿病患者慢性血管病变的高度重视，对糖尿病患者动脉平滑肌细胞的生物学特性的研究逐渐成为热点。因此，提高糖尿病动脉平滑肌细胞体外培养的成活率和稳定性是关键。近年来，随着细胞培养技术的发展，血管平滑肌细胞原代培养的成活率有了明显提高[1-3]，但是众多技术仍存在缺陷。我们在比较众多培养方法[4-5]的情况下，对传统酶消化法进行大胆改良，从取材方法到酶消化等许多方面进行了改良，结果证明改良的酶消化法简单，经济，成活率高，细胞传代快，生长稳定，纯度较高，现将该方法介绍如下。
1 材料与方法
1.1 糖尿病Wister大鼠模型制备
Wister大鼠，鼠龄8周，SPF级，由佳木斯大学实验动物中心提供。糖尿病大鼠模型采用链脲佐菌素腹腔注射+高脂高糖食物饲养自制，一共20只。
1.2 主要试剂及仪器
①主要试剂：0.5%台盼蓝，一抗特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（北京中山生物公司），DAB显色剂，乙醚，不含钙镁磷酸盐缓冲液（D-PBS），D-Hanks液等。②培养基：在DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）培养基中添加15%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素，200目筛，一次性过滤除菌器除菌备用（4周内用完）。③酶消化液：0.5%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸· 4钠（0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na），过滤除菌即用。④75%乙醇：用超纯水配制。⑤器械及仪器：齿镊，平镊，组织剪，眼科剪，T25培养瓶，培养皿，体式解剖显微镜，倒置显微镜，细胞计数板，盖玻片，超净工作台，1 mL、5 mL无菌注射器等。
1.3 改良酶消化法体外培养细胞
①糖尿病Wister大鼠用乙醚进行麻醉，待麻醉生效后，将糖尿病Wister大鼠全部浸入75%乙醇中消毒，消毒后在超净工作台中打开胸腔及腹腔，暴露心脏、胸主动脉和腹主动脉，止血。②在心脏跳动时，用5 mL注射器穿刺左心室，注入无菌D-PBS，冲洗。③仔细分离主动脉并剪断，迅速移入无菌平皿，滴入D-Hanks浸过主动脉。④在体式解剖显微镜下完整去除血管外膜至血管光滑透明，用无菌棉签轻轻擦去内膜，用培养液冲洗中膜。⑤将中膜置入另一有D-Hanks的培养皿中，用眼科剪将血管中膜快速剪成1.0 mm2大小组织块，过200目筛，轻轻研磨，不断用含15%的胎牛血清的培养液冲洗，直至剩下白色组织间质，取冲洗液，1 500 r/min（r=13.5 cm）离心5 min，弃上清，取沉淀。⑥往沉淀物中加入DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）5 mL，加入0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na消化30 s。⑦加入等体积DMEM培养基终止消化并1 500 r/min（r=13.5 cm）离心5 min，弃上清液，离心管中加入2 mL新鲜培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶，常规静置培养。⑧24 h后在倒置显微镜下观察培养瓶情况，细胞是否处于成团状态，若团块较大，则重复⑥、⑦步骤，视情况分阶梯重复酶消化直至全部成为单细胞。⑨48 h后观察培养瓶是否有污染，培养液是否变黄等，如有需换新鲜培养液，静置培养。于第7、8 d细胞生长达培养皿面积的85%左右时常规方法传代。
1.4 细胞形态学观察
原代及传代培养时，采用倒置相差显微镜常规观察细胞的生长形态，于72 h后按细胞悬液与0.5%台盼蓝溶液以9：1混合混匀（终浓度0.04%）后染色，用细胞计数板在倒置相差显微镜下进行细胞计数，计数3 min，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。随机计数6个视野，共计数600个细胞，计算活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100% [6]。
1.5 血管平滑肌细胞鉴定
细胞免疫化学鉴定血管平滑肌细胞[7]：制备单细胞悬液，铺板，石蜡包埋，石蜡切片，脱蜡、脱水，蒸馏水冲洗，D-PBS浸泡5 min；3% H2O2室温孵育5～10 min，D-PBS冲洗5 min，反复3次。5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，弃血清，滴加血管平滑肌细胞特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（1：200），37℃孵育1～2 h，D-PBS冲洗5 min，反复3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG工作液（1：100），37℃孵育10～30 min；D-PBS冲洗5 min，反复3次，DAB显色剂显色，自来水冲洗，复染，脱水透明，封固。用荧光显微镜观察。
2 结果
2.1 血管平滑肌细胞体外生长情况
细胞于24 h时开始游离出（图 1A）；48 h时呈放射状生长（图 1B），呈梭形；72 h时呈峰谷样生长（图 1C）。传2代后细胞生长较快，呈典型的峰谷样生长，细胞形态多呈宽大的长梭形，核大。细胞计数活细胞率达96%。
图1
示培养不同时相后的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的生长情况（倒置相差显微镜×100）。1A：第24 h；1B：第48 h；1C：第72 h，呈峰谷样生长 图 2糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白染色结果（荧光显微镜×200）
Figure1.
Growth of vascular smooth muscle cells in diabetic rat at different time after culture (Inverted phase contrast microscope×100). 1A:At hour 24;1B:At hour 48;1C:At hour 72, exhibited typical "hill and valley" pattern Figure 2 Positiveα-SMA in vascular smooth muscle cells of diabetic rat (Fluorescence microscope×200)
2.2 体外培养的血管平滑肌细胞鉴定结果
细胞免疫化学检测可见细胞形态不规则，胞浆内出现肌丝，具备平滑肌细胞特征；阳性细胞质内有大量淡蓝色、与细胞长轴平行的纤维细丝，细胞核卵圆形居中，不着色。见图 2。
3 讨论
糖尿病血管并发症是糖尿病患者的主要致残、致死原因[8]。流行病学调查研究[9-10]表明，糖尿病患者发生心脑血管并发症的危险性较非糖尿病患者增加34倍。血管平滑肌细胞是动脉壁的主要组成成分，在糖尿病血管并发症的动脉粥样硬化形成中起着关键作用，因此对血管平滑肌细胞的研究有着重要的意义。在过去的研究[11-15]中，均采用正常大鼠主动脉平滑肌细胞建立体外细胞培养模型，这些方式不能从根本上说明糖尿病血管平滑肌细胞病变的病理机制。本实验首先将SPF级Wister大鼠成功建立糖尿病模型，再取其主动脉平滑肌细胞进行体外培养，成功培育出糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞。我们在长期的糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养实验中观察到：糖尿病大鼠动脉平滑肌细胞与正常大鼠主动脉平滑肌细胞在形态学方面均不存在差异，但其生长速度明显较正常大鼠快；正常大鼠的主动脉平滑肌细胞需要5～8 d从细胞团中游出，20 d左右才铺满培养瓶；而糖尿病大鼠的主动脉平滑肌细胞只需3～4 d即可从细胞团游中出，10 d左右可铺满培养瓶，说明糖尿病状态下主动脉平滑肌细胞呈现异常增殖状态，这可能与高血糖引起主动脉平滑肌细胞增殖过快[16]有关。
传统的体外细胞原代培养方法[17-19]有两种：第一种是酶消化法，将血管组织块用适宜的酶消化后再行培养，因此方法除去了细胞间质，所以产量高，但是因其步骤繁琐，易发生污染，材料消耗较多，适用于大块组织的细胞培养；第二种是组织块贴壁培养法，在活体时将组织取出，剪切成小块，贴于瓶壁等待细胞从组织游离出，该法细胞生长慢且不是每块都能长出细胞，成功率不高，适合组织量少的细胞培养，上述两种均存在一定的弊端。
我们在长期的实验中反复探索、对比针对糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞的特点，对传统的酶消化方法进行大胆改良，建立了上述改良的糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞体外原代培养方法，该实验方法将传统复杂的酶消化法进行简化改良：即先在体式解剖显微镜下分离血管中膜，将组织块过200目筛，随后进行梯度酶消化，显著降低血管组织的损失，减少对血管平滑肌细胞的损伤，减少操作污染的机会，使操作方法简单易学，可重复性强，体外培养的细胞活力强、生长快、稳定。如果注意以下6项，可显著提高细胞成活率：①无菌观念。所用器械要严格按要求消毒灭菌，操作过程均无菌操作。②选鼠龄8周以上5个月以内成年大鼠，若鼠龄在5个月以上，作原代培养时细胞不易从组织块中游出；若为幼鼠，大鼠在糖尿病造模后的喂养过程中极易衰竭而死。③用体式解剖显微镜除去外膜和内膜，因视野放大能去除干净血管外膜和内膜。④时间控制。原代细胞培养中翻瓶时间以5～7 d为宜，前3 d一定要静置培养，防止细胞团震荡降低成功率。⑤掌握好酶消化时间，若为新鲜的胰酶，胰酶浓度不要超过0.5%，消化2 min或略长即可。⑥培养液和血清，选用DMEM高糖培养基，含L-谷氨酰胺，配制时要用新鲜烧制的三蒸水或超纯水，严格调定pH值，最好使用以胎牛血清：新生牛血清=1：1比例混合血清。
在传统的酶消化法基础上进行改良，建立了良好、稳定的糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞原代体外培养体系，适用于其外源性增殖、凋亡、死亡、变异、离子通道、基因层次以及其他形态学的研究，为今后糖尿病血管病变的研究和防治提供试验基础以及靶向治疗的靶点。
近几年糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐渐增加，引起了血管外科医生对糖尿病患者慢性血管病变的高度重视，对糖尿病患者动脉平滑肌细胞的生物学特性的研究逐渐成为热点。因此，提高糖尿病动脉平滑肌细胞体外培养的成活率和稳定性是关键。近年来，随着细胞培养技术的发展，血管平滑肌细胞原代培养的成活率有了明显提高[1-3]，但是众多技术仍存在缺陷。我们在比较众多培养方法[4-5]的情况下，对传统酶消化法进行大胆改良，从取材方法到酶消化等许多方面进行了改良，结果证明改良的酶消化法简单，经济，成活率高，细胞传代快，生长稳定，纯度较高，现将该方法介绍如下。
1 材料与方法
1.1 糖尿病Wister大鼠模型制备
Wister大鼠，鼠龄8周，SPF级，由佳木斯大学实验动物中心提供。糖尿病大鼠模型采用链脲佐菌素腹腔注射+高脂高糖食物饲养自制，一共20只。
1.2 主要试剂及仪器
①主要试剂：0.5%台盼蓝，一抗特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（北京中山生物公司），DAB显色剂，乙醚，不含钙镁磷酸盐缓冲液（D-PBS），D-Hanks液等。②培养基：在DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）培养基中添加15%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素，200目筛，一次性过滤除菌器除菌备用（4周内用完）。③酶消化液：0.5%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸· 4钠（0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na），过滤除菌即用。④75%乙醇：用超纯水配制。⑤器械及仪器：齿镊，平镊，组织剪，眼科剪，T25培养瓶，培养皿，体式解剖显微镜，倒置显微镜，细胞计数板，盖玻片，超净工作台，1 mL、5 mL无菌注射器等。
1.3 改良酶消化法体外培养细胞
①糖尿病Wister大鼠用乙醚进行麻醉，待麻醉生效后，将糖尿病Wister大鼠全部浸入75%乙醇中消毒，消毒后在超净工作台中打开胸腔及腹腔，暴露心脏、胸主动脉和腹主动脉，止血。②在心脏跳动时，用5 mL注射器穿刺左心室，注入无菌D-PBS，冲洗。③仔细分离主动脉并剪断，迅速移入无菌平皿，滴入D-Hanks浸过主动脉。④在体式解剖显微镜下完整去除血管外膜至血管光滑透明，用无菌棉签轻轻擦去内膜，用培养液冲洗中膜。⑤将中膜置入另一有D-Hanks的培养皿中，用眼科剪将血管中膜快速剪成1.0 mm2大小组织块，过200目筛，轻轻研磨，不断用含15%的胎牛血清的培养液冲洗，直至剩下白色组织间质，取冲洗液，1 500 r/min（r=13.5 cm）离心5 min，弃上清，取沉淀。⑥往沉淀物中加入DMEM（高糖、含L-谷氨酰胺）5 mL，加入0.5%TRYPSIN+0.02% EDTA · 4Na消化30 s。⑦加入等体积DMEM培养基终止消化并1 500 r/min（r=13.5 cm）离心5 min，弃上清液，离心管中加入2 mL新鲜培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶，常规静置培养。⑧24 h后在倒置显微镜下观察培养瓶情况，细胞是否处于成团状态，若团块较大，则重复⑥、⑦步骤，视情况分阶梯重复酶消化直至全部成为单细胞。⑨48 h后观察培养瓶是否有污染，培养液是否变黄等，如有需换新鲜培养液，静置培养。于第7、8 d细胞生长达培养皿面积的85%左右时常规方法传代。
1.4 细胞形态学观察
原代及传代培养时，采用倒置相差显微镜常规观察细胞的生长形态，于72 h后按细胞悬液与0.5%台盼蓝溶液以9：1混合混匀（终浓度0.04%）后染色，用细胞计数板在倒置相差显微镜下进行细胞计数，计数3 min，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。随机计数6个视野，共计数600个细胞，计算活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100% [6]。
1.5 血管平滑肌细胞鉴定
细胞免疫化学鉴定血管平滑肌细胞[7]：制备单细胞悬液，铺板，石蜡包埋，石蜡切片，脱蜡、脱水，蒸馏水冲洗，D-PBS浸泡5 min；3% H2O2室温孵育5～10 min，D-PBS冲洗5 min，反复3次。5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，弃血清，滴加血管平滑肌细胞特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（1：200），37℃孵育1～2 h，D-PBS冲洗5 min，反复3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG工作液（1：100），37℃孵育10～30 min；D-PBS冲洗5 min，反复3次，DAB显色剂显色，自来水冲洗，复染，脱水透明，封固。用荧光显微镜观察。
2 结果
2.1 血管平滑肌细胞体外生长情况
细胞于24 h时开始游离出（图 1A）；48 h时呈放射状生长（图 1B），呈梭形；72 h时呈峰谷样生长（图 1C）。传2代后细胞生长较快，呈典型的峰谷样生长，细胞形态多呈宽大的长梭形，核大。细胞计数活细胞率达96%。
图1
示培养不同时相后的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的生长情况（倒置相差显微镜×100）。1A：第24 h；1B：第48 h；1C：第72 h，呈峰谷样生长 图 2糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白染色结果（荧光显微镜×200）
Figure1.
Growth of vascular smooth muscle cells in diabetic rat at different time after culture (Inverted phase contrast microscope×100). 1A:At hour 24;1B:At hour 48;1C:At hour 72, exhibited typical "hill and valley" pattern Figure 2 Positiveα-SMA in vascular smooth muscle cells of diabetic rat (Fluorescence microscope×200)
2.2 体外培养的血管平滑肌细胞鉴定结果
细胞免疫化学检测可见细胞形态不规则，胞浆内出现肌丝，具备平滑肌细胞特征；阳性细胞质内有大量淡蓝色、与细胞长轴平行的纤维细丝，细胞核卵圆形居中，不着色。见图 2。
3 讨论
糖尿病血管并发症是糖尿病患者的主要致残、致死原因[8]。流行病学调查研究[9-10]表明，糖尿病患者发生心脑血管并发症的危险性较非糖尿病患者增加34倍。血管平滑肌细胞是动脉壁的主要组成成分，在糖尿病血管并发症的动脉粥样硬化形成中起着关键作用，因此对血管平滑肌细胞的研究有着重要的意义。在过去的研究[11-15]中，均采用正常大鼠主动脉平滑肌细胞建立体外细胞培养模型，这些方式不能从根本上说明糖尿病血管平滑肌细胞病变的病理机制。本实验首先将SPF级Wister大鼠成功建立糖尿病模型，再取其主动脉平滑肌细胞进行体外培养，成功培育出糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞。我们在长期的糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养实验中观察到：糖尿病大鼠动脉平滑肌细胞与正常大鼠主动脉平滑肌细胞在形态学方面均不存在差异，但其生长速度明显较正常大鼠快；正常大鼠的主动脉平滑肌细胞需要5～8 d从细胞团中游出，20 d左右才铺满培养瓶；而糖尿病大鼠的主动脉平滑肌细胞只需3～4 d即可从细胞团游中出，10 d左右可铺满培养瓶，说明糖尿病状态下主动脉平滑肌细胞呈现异常增殖状态，这可能与高血糖引起主动脉平滑肌细胞增殖过快[16]有关。
传统的体外细胞原代培养方法[17-19]有两种：第一种是酶消化法，将血管组织块用适宜的酶消化后再行培养，因此方法除去了细胞间质，所以产量高，但是因其步骤繁琐，易发生污染，材料消耗较多，适用于大块组织的细胞培养；第二种是组织块贴壁培养法，在活体时将组织取出，剪切成小块，贴于瓶壁等待细胞从组织游离出，该法细胞生长慢且不是每块都能长出细胞，成功率不高，适合组织量少的细胞培养，上述两种均存在一定的弊端。
我们在长期的实验中反复探索、对比针对糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞的特点，对传统的酶消化方法进行大胆改良，建立了上述改良的糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞体外原代培养方法，该实验方法将传统复杂的酶消化法进行简化改良：即先在体式解剖显微镜下分离血管中膜，将组织块过200目筛，随后进行梯度酶消化，显著降低血管组织的损失，减少对血管平滑肌细胞的损伤，减少操作污染的机会，使操作方法简单易学，可重复性强，体外培养的细胞活力强、生长快、稳定。如果注意以下6项，可显著提高细胞成活率：①无菌观念。所用器械要严格按要求消毒灭菌，操作过程均无菌操作。②选鼠龄8周以上5个月以内成年大鼠，若鼠龄在5个月以上，作原代培养时细胞不易从组织块中游出；若为幼鼠，大鼠在糖尿病造模后的喂养过程中极易衰竭而死。③用体式解剖显微镜除去外膜和内膜，因视野放大能去除干净血管外膜和内膜。④时间控制。原代细胞培养中翻瓶时间以5～7 d为宜，前3 d一定要静置培养，防止细胞团震荡降低成功率。⑤掌握好酶消化时间，若为新鲜的胰酶，胰酶浓度不要超过0.5%，消化2 min或略长即可。⑥培养液和血清，选用DMEM高糖培养基，含L-谷氨酰胺，配制时要用新鲜烧制的三蒸水或超纯水，严格调定pH值，最好使用以胎牛血清：新生牛血清=1：1比例混合血清。
在传统的酶消化法基础上进行改良，建立了良好、稳定的糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞原代体外培养体系，适用于其外源性增殖、凋亡、死亡、变异、离子通道、基因层次以及其他形态学的研究，为今后糖尿病血管病变的研究和防治提供试验基础以及靶向治疗的靶点。
