• 1. 哈尔滨医科大学附属第一医院肝脾外科教育部重点实验室(哈尔滨 150001);
  • 2. 哈尔滨医科大学附属第四医院普外三科(哈尔滨 150001);
  • 3. 哈尔滨医科大学附属第一医院甲状腺外科(哈尔滨 150001);
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目的 建立乐伐替尼肝细胞肝癌(简称“肝癌”)细胞耐药模型,以研究双硫仑联合铜离子对乐伐替尼耐药细胞 Huh7 增殖和凋亡的影响。方法 通过 CCK8 法检测乐伐替尼作用下 Huh7 细胞的半抑制浓度(IC50),采用浓度递增法诱导 Huh7 细胞乐伐替尼耐药。各组细胞处理:对照组为 Huh7 细胞加普通培养液培养后的细胞;敏感组为 Huh7 细胞加 10 μmol/L 乐伐替尼培养后的细胞;耐药组为耐药 Huh7 细胞加 10 μmol/L 乐伐替尼培养后的细胞;联合组为耐药 Huh7 细胞加 10 μmol/L 乐伐替尼+1 μmol/L 双硫仑+0.5 μmol/L 铜离子培养后的细胞;抑制剂组为耐药 Huh7 细胞加 10 μmol/L 乐伐替尼+10 μmol/L Akt 抑制剂 MK2206 培养后的细胞。CCK8 法及流式细胞术分别检测细胞的存活率和凋亡率;Western blot 法检测磷酸化-Akt(p-Akt)和半胱氨酸蛋白酶 9(caspase-9)和 B 淋巴细胞瘤 2(Bcl-2)蛋白表达;Transwell 法检测细胞侵袭性。结果 乐伐替尼耐药细胞系成功建立,选取 10、20、40、60、80 及 160 μmol/L 6 个乐伐替尼浓度对 Huh7 细胞作用 48 h 后计算得出细胞 IC50 为 12.35 μmol/L。耐药组细胞存活率明显高于敏感组(P<0.01),联合组细胞存活率明显低于耐药组(P<0.01),抑制剂组细胞存活率明显低于耐药组(P<0.01)。与耐药组比较,联合组及抑制剂组 p-Akt 蛋白表达明显降低(P<0.01)、caspase-9 明显升高(P<0.01),而 Bcl-2 蛋白在耐药组和联合组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合组细胞凋亡率明显高于耐药组(P<0.01)。Transwell 结果显示联合组的肿瘤细胞侵袭数明显少于耐药组(P<0.01)。结论 双硫仑联合铜离子能增加乐伐替尼对乐伐替尼耐药肝癌细胞 Huh7 的敏感性,同耐药组相比其细胞抑制率明显提高,其机制可能与抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt 通路及促进 caspase-9 蛋白表达有关。