原发性肝癌是全球高发肿瘤，在我国发病人数排名第 4 位，病死率高居第 2 位[1-2]。根据组织学类型，原发性肝癌可分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、胆管细胞癌和混合型肝癌，其中我国的原发性肝癌中 85%～90% 为 HCC[3]。HCC 的常见致病因素包括肝炎病毒感染、酒精、脂肪肝等，其常规治疗方式包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、经导管动脉化疗栓塞（TACE）、放疗等多种手段，这些治疗手段多在早期 HCC 患者中疗效较好，但对于晚期 HCC 患者疗效欠佳。21 世纪发展起来的分子靶向药物（如索拉非尼、仑伐替尼、阿西替尼等）虽能缓解肿瘤负荷、改善肿瘤相关症状，但对于提高患者总生存期及客观应答率的作用仍然有限[4]。基于对 HCC 发生发展分子机制的精准研究和肿瘤免疫治疗方法的快速发展，越来越多的晚期 HCC 患者开始从免疫治疗方法中获益。肿瘤免疫治疗是通过增强或恢复免疫系统的监视和杀伤能力，克服肿瘤逃避和抑制免疫反应的机制，纠正原有肿瘤微环境出现的免疫耐受、炎症免疫反应失衡等问题，从而杀伤肿瘤细胞[5]。根据不同的作用环节，免疫治疗策略可分为肿瘤疫苗、免疫检查点阻断治疗、过继细胞免疫治疗方法、非特异性免疫调节剂等[6]。在应用于 HCC 治疗的免疫治疗方案中，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗的疗效尤为显著，患者临床获益较高，但单一免疫治疗获益较少，临床应答率较低。有研究[7]显示，ICIs 联合靶向治疗如抗血管生成抑制剂方案（IMbrave150）能有效地克服耐药和提高疗效，已成为晚期 HCC 新的一线治疗方案。目前，有更多免疫联合治疗的临床研究也正在如火如荼地开展。笔者现对当前应用 ICIs 及其免疫联合治疗晚期 HCC 的研究现状及临床试验进展进行综述。
1 HCC 的免疫学特点
肝脏是一个免疫耐受性器官，为避免外源性肠道抗原经门静脉入肝后肝脏代谢作用引起过度免疫反应而形成了高度器官特异性免疫；由慢性肝炎和肝硬化发展形成的 HCC，其肝脏微环境改变和免疫细胞比例严重失衡[8-9]；此外，肝脏还存在多种免疫抑制机制和现象，如免疫抑制细胞群募集、自然杀伤（NK）细胞和 CD4+ T 细胞功能受损、抗原提呈缺陷及多个抑制性受体-配体通路的激活，进一步导致免疫耐受和免疫逃逸[10]。在免疫抑制细胞群中，调节性 T 细胞和髓样来源抑制细胞在血液循环和肿瘤内大量聚集，抑制效应性 CD4+、CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）的活化、增殖及其功能，降低 NK 细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒效应；另外，调节性树突状细胞通过高分泌白介素-10 和吲哚胺 2,3-双加氧酶来抑制 T 细胞活化[11]；同时 HCC 通过低表达共刺激分子（如 B7-1、B7-2）以及高表达主要组织相容性复合物Ⅱ类分子和免疫检查点分子，使得肿瘤特异性 T 细胞因缺乏共刺激信号而无法活化、增殖，并通过下调或不表达 Fas 蛋白而逃避自身凋亡[12]。总之，HCC 通过抑制机体免疫功能以及调控自身分子表达来逃逸机体免疫监视，形成高度免疫抑制型微环境，从而使传统放化疗和分子靶向药物的疗效受限。
2 ICIs
免疫检查点是在免疫细胞上表达、T 细胞抗原受体识别抗原启动阶段的抑制信号分子，在防止 T 细胞过度激活导致的炎症组织损伤和维持自身免疫中起保护作用。ICIs 治疗是利用靶向免疫检查点分子的特异性单克隆抗体（简称“单抗”）或抑制剂消除免疫抑制信号并释放免疫系统“刹车”，从而增强内源性抗肿瘤免疫应答[13-14]。免疫检查点分子主要包括程序性死亡受体 1（PD-1）及其配体 1（PD-L1）、CTL 相关蛋白 4（CTLA-4）、T 细胞免疫球蛋白-3、淋巴细胞活化基因-3 等，其中靶向结合 PD-1、PD-L1 和 CTLA-4 单抗已成为目前 HCC 免疫治疗的重要选择；另一方面，基于免疫检查点的免疫抑制原理，通过检测关键分子的基线表达水平可预测 ICIs 治疗 HCC 的疗效，也可用于筛选 ICIs 治疗获益优势人群。既往研究[15]表明，肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、PD-L1 表达水平、肿瘤浸润性淋巴细胞、T 细胞受体克隆性、基因表达特征等与 ICIs 的疗效有关。例如，在黑色素瘤、结肠癌、非小细胞肺癌患者中，高肿瘤突变负荷或微卫星不稳定性患者接受 ICIs 治疗的响应率高且预后较好，但在 HCC 患者中尚不明确[16-17]。因此，尚需更多研究来明确 HCC 组织和血清免疫检查点分子的临床指示意义，确定与疾病缓解或预后相关的生物标志物，以优化在 HCC 患者中基于 ICIs 的精准治疗策略，提升患者的临床获益。以下对于主要的 ICIs 以及免疫联合治疗方案进行详细介绍，ICIs 及免疫联合治疗用于 HCC 患者的主要临床试验见表 1。
表1
ICIs 治疗和免疫联合治疗 HCC 的主要临床研究结果
2.1 PD-1 单抗
PD-1 是 CD28 家族成员，多表达于活化的 T 细胞、B 细胞和髓系细胞上，对免疫系统起负性调节作用；PD-L1 在正常外周组织和活化的免疫细胞均有组成性表达[18]，而肿瘤细胞表面高表达 PD-L1 分子能与 T 细胞的受体 PD-1 结合，使 T 细胞未能激活和增殖，以致肿瘤细胞能逃逸免疫监视和特异性杀伤效应[19]。PD-1/PD-L1 单抗可靶点阻断 PD-L1 蛋白与 PD-1 受体结合，恢复免疫识别和杀伤，使 T 细胞正常发挥抗肿瘤免疫应答作用[20]。目前美国食品和药物管理局（FDA）已批准两种 PD-1 单抗即纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）治疗既往索拉非尼治疗后进展或无法耐受索拉非尼的晚期 HCC 患者[21-22]。
Ⅰ/Ⅱ期多中心开放式非对照临床试验 CheckMate040（NCT01658878）[21]结果表明，纳武利尤单抗治疗既往索拉非尼治疗后进展的晚期 HCC 患者，客观应答率可达 20%，包括 2 次完全应答和 64% 的疾病稳定率，且中位总生存期达到 15.6 个月，其中 HCC 组织免疫组织化学 PD-L1 阳性和阴性患者客观应答率分别为 27.7% 和 15.7%，总生存期分别为 28.1 个月和 16.6 个月，且均获得临床缓解。基于这些结果，FDA 迅速批准了纳武利尤单抗用于晚期 HCC 二线治疗，同时也表明 PD-L1 是预测抗 PD-1 疗效的可行标志物，但尚未作为临床指导用药的依据。来自德国 3 个中心的回顾性临床研究[23]分析 34 例晚期 HCC 患者接受纳武利尤单抗治疗后，4 例（11.8%）部分缓解，8 例（23.5%）病情稳定，初步验证了其疗效和安全性。然而在 2019 年欧洲肿瘤内科学会年会（ESMO）报告纳武利尤单抗一线治疗晚期 HCC 患者的Ⅲ期临床试验 CheckMate459（NCT02576509）[24]结果，相比于索拉非尼，纳武利尤单抗未达到预先指定的延长总生存期、提高耐受性的主要终点，但确有临床意义的总生存率、客观缓解率和完全缓解率的显著改善，进一步说明纳武利尤单抗相比索拉菲尼治疗晚期 HCC 在疗效和安全性上更优。
同样，Ⅱ期临床试验 Keynote224（NCT02702414）[22]表明，帕博利珠单抗用于治疗晚期 HCC 患者具有较好的临床疗效和安全性，因此 FDA 随后也批准了帕博利珠单抗用于晚期 HCC 的二线治疗。然而在帕博利珠单抗联合最佳支持治疗对比安慰剂联合最佳支持治疗的Ⅲ期临床试验 Keynote240（NCT02702401）[25]中，相比对照组，帕博利珠单抗组未达到预定的统计学阈值，但患者总生存期和无进展生存期均有明显改善，死亡和进展风险均下降 22%，帕博利珠单抗的疗效得到进一步验证。目前我国也正在开展采用帕博利珠单抗二线治疗接受过系统治疗的晚期 HCC 患者的Ⅲ期临床试验研究 Keynote-394，该药治疗我国肝癌患者的疗效评估结果值得期待。
另一人源化 PD-1 单抗，卡瑞利珠单抗（camrelizumab），早在 2018 年 ESMO 年会即有报告其二线治疗我国晚期 HCC 患者的临床疗效，治疗组表现出较高的客观应答率、持久的免疫反应和可接受的不良反应[26]。因其良好临床疗效[27]而被我国国家药品监督管理局批准用于接受过索拉非尼治疗或含奥沙利铂系统化疗的晚期 HCC 患者的治疗，成为我国首个被批准治疗晚期 HCC 患者的 PD-1 单抗。
在最新 2020 年中国临床肿瘤学会（CSCO）肝癌指南的二线治疗中将上述 3 种 PD-1 单抗提升到Ⅰ级推荐（2A 级证据）。
2.2 PD-L1 单抗
目前 PD-L1 单抗正处于晚期 HCC 临床试验的评估阶段，包括阿韦单抗（avelumab）、度伐利尤单抗（durvalumab）和阿特珠单抗（atezolizumab）。阿韦单抗治疗晚期 HCC 患者的疗效正在Ⅱ期研究（NCT03389126）中进行评估。度伐利尤单抗已在早期Ⅱ期临床研究（NCT01693562）[28]中报道治疗晚期 HCC 患者疗效和安全性较好。阿特珠单抗已被用于非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌免疫治疗，而关于 HCC 研究更多集中在对其联合治疗疗效评估，并在与抗血管抑制剂联合治疗中表现优异。因此可见，PD-1/PD-L1 单抗均能显著延长晚期 HCC 患者总生存期，减少治疗相关不良反应并改善预后。
2.3 CTLA-4 单抗
CTLA-4 是 T 细胞表达的白细胞分化抗原，CTLA-4 与 CD28 分子竞争结合抗原提呈细胞表面配体 CD80/CD86，启动抑制性信号，从而限制 T 细胞的激活和增殖[29]。CTLA-4 单抗是通过阻断 CTLA-4 与其配体结合来刺激 T 细胞活化、增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。CTLA-4 单抗是最早应用于临床的 ICIs。2011 年 FDA 批准上市了第一个靶向 CTLA-4 人源化单抗伊匹单抗（ipilimumab）用于治疗晚期黑色素瘤患者[30]。另一个 CTLA-4 单抗曲美单抗（tremelimumab）正处于晚期黑色素瘤、肝癌以及结直肠癌的临床试验并被 FDA 授予了治疗 HCC 的孤儿药资格。在一项Ⅱ期临床试验（NCT01008358）中，17 例既往索拉非尼治疗后进展、与丙型肝炎病毒相关 HCC 患者接受曲美单抗治疗后，患者的客观应答率和疾病稳定率分别为 17.6% 和 76.4%，疾病进展的中位时间为 6.48 个月，而 3/4 级不良反应发生率为 45%[31]。曲美单抗有良好的治疗潜力，但同时也需要进一步探索预测免疫反应的生物标志物和潜在的联合治疗策略，以克服 ICIs 治疗中较高的不良反应发生率和低应答率（10%～20%）的问题。
3 免疫联合治疗
3.1 双 ICIs 联合治疗
临床前研究[37-38]数据表明，PD-1/PD-L1 单抗与 CTLA-4 单抗联合治疗具有协同抗肿瘤活性，并在纳武利尤单抗与伊匹单抗联合治疗晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验[39]中得到验证。一项旨在研究度伐利尤单抗联合曲美单抗治疗晚期 HCC 患者的 I / II 期临床试验（NCT02519348）[32]正在进行中，基于 40 例病例的初步研究结果显示客观应答率为 15%，疾病稳定率为 57.5%。2019 年美国临床肿瘤协会（ASCO）年会的一项报告[33]表明，纳武利尤单抗与伊匹单抗联合治疗 148 例晚期 HCC 患者结果，客观应答率为 31%，有 7 例（5%）完全应答，更加验证了双免联合治疗的优越性，基于此结果，FDA 加速审批了纳武利尤单抗（O 药）+伊匹单抗（Y 药）双免方案为首个唯一用于 HCC 二线治疗的双免疗法。
3.2 ICIs 联合抗血管生成抑制剂
肿瘤的生长会加快血管异生，进而导致肿瘤微环境中血管渗漏、缺氧和多条免疫抑制通路的激活。血管内皮生长因子（VEGF）是促进肿瘤血管生成的重要因子，抗血管生成抑制剂可通过抑制 VEGF 诱导肿瘤血管的正常化，重塑肿瘤微环境来减少免疫抑制途径[40]。临床前研究[41]表明，这种联合疗法可促进抗原提呈细胞的成熟和 CTL 的活化和浸润，减少肿瘤组织中髓样来源的抑制细胞和调节性 T 细胞的浸润，可协同促进对肿瘤的清除作用。贝伐单抗（bevacizumab）是人源化抗 VEGF 的单抗，在Ⅰb 期研究（NCT02715531）[34]中，研究者将阿特珠单抗单一疗法和阿特珠单抗联合贝伐单抗疗法治疗晚期 HCC 患者的疗效和安全性进行对比，发现联合治疗能显著提高患者总生存期和应答率。最新公布的Ⅲ期临床试验 IMbrave150（NCT03434379）[7]研究结果表明，阿特珠单抗联合贝伐单抗相比索拉非尼治疗共 501 例转移或无法切除的晚期 HCC 患者，联合治疗方案使患者死亡风险相对下降了 42%，12 个月生存率提高到 67.2%，显著延长患者的总生存时间和无瘤生存时间。该类联合方案突破了不可切除 HCC 患者生存瓶颈，并被 FDA 批准用于治疗既往未接受过系统治疗的不可切除 HCC 患者，成为首个获批的肝癌一线免疫疗法。同时期我国开展的一项Ⅰb 期临床研究（NCT04072679）[42]共纳入 50 例晚期 HCC 患者，分别接受低剂量和高剂量 PD-1 单抗信迪利单抗联合贝伐珠单抗生物类似药 IBI305 治疗后，高剂量组客观应答率高达 33.3%，疾病稳定率高达 83.3%，更加验证了此类联合治疗的疗效和安全性较好。在美国国立综合癌症网络（NCCN）和 CSCO 最新发布的肝癌指南的一线治疗中都将此联合方案推荐为Ⅰ级（1A 类证据）。
3.3 ICIs 联合多靶点酪氨酸激酶抑制剂
多靶点酪氨酸激酶抑制剂（如索拉非尼、仑伐替尼）是可抑制蛋白酪氨酸激酶介导的多个信号传导通路，抑制肿瘤细胞的增殖，阻断新生血管生成，同时具有免疫调节作用（如减少髓样来源的抑制细胞和调节性 T 细胞，增强 NK 细胞和 T 细胞的肿瘤浸润和活化）的抗肿瘤药物。2019 年 ASCO 年会公布了阿特珠单抗联合阿西替尼治疗晚期 HCC 的临床数据，结果显示客观应答率为 13.6%，中位无进展生存时间可达 5.5 个月，但联合治疗加重了单药治疗的毒性，3/4 级治疗相关不良反应率为 72.7%[35]。提示联合治疗方案效果显著，但联合用药的剂量、周期仍需探索。另外，还有两项临床试验[43-44]COSMIC-312 试验（NCT03755791）中的阿特珠单抗联合卡博替尼疗法和 LEAP-002 试验（NCT03713593）中的帕博利珠单抗联合仑伐替尼疗法正在评估这类联合治疗的疗效和安全性。NCCN 指南基于 REFLECT 试验结果[45]将仑伐替尼一线治疗推荐等级由 2A 类上升为 1 类。在 CSCO 肝癌指南一线治疗Ⅲ级推荐中新增帕博利珠单抗联合仑伐替尼、卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼/奥沙利铂为主的系统化疗。
3.4 ICIs 联合其他治疗
化疗、放疗、介入治疗等可通过杀死肿瘤细胞后释放肿瘤抗原，如基于奥沙利铂的化疗（如 FOLFOX4、GEMOX 方案）可诱导免疫原性细胞死亡[46]，联用 ICIs 可以进一步维持或增强抗原提呈细胞激活 T 细胞的功能，从而促进肿瘤特异性免疫反应。目前一项比较卡瑞利珠单抗联合 FOLFOX4 方案与 FOLFOX4 方案或索拉非尼一线治疗晚期 HCC 疗效的Ⅱ期临床试验（NCT03092895）正在评估中，基于 34 例病例结果[36]显示，客观应答率和疾病稳定率分别为 26.5%、79.8%，中位无瘤生存时间可达 5.5 个月，中位总生存时间尚未达到，3 级以上免疫相关不良反应发生率仅为 5.9%，提示这类联合治疗方法的疗效和安全性可观。在 CSCO 指南二线治疗中将“既往使用过索拉菲尼患者可考虑卡瑞利珠单抗联合 FOLFOX4 方案”列为Ⅱ级推荐。在一项回顾性临床病例分析中，5 例晚期 HCC 患者接受立体定向放疗联合纳武利尤单抗治疗后，2 例完全缓解，3 例部分缓解，中位无进展生存时间可达 14.9 个月，1 年内均达到局部控制和存活[47]；另一项研究[48]报道选择性内放疗能增强 HCC 患者免疫细胞激活和募集，特别是表达 PD-1 的免疫细胞。以上两项研究均提示放疗与 ICIs 联合治疗具有协同作用，但缺乏前瞻性临床研究验证。在一项 TACE、射频消融或冷消融联合曲美单抗治疗晚期 HCC 患者的早期临床试验中，患者中位疾病进展时间为 7.4 个月，中位总生存时间为 12.3 个月，验证了这类联合治疗的可行性，但仍需进一步明确其疗效和安全性。一项临床试验 NCT03397654[49]正在评估帕博利珠单抗联合 TACE 治疗晚期 HCC 患者的有效性和安全性。因此，免疫治疗联合局部治疗是实现 HCC 患者的精准个体化治疗的重要方向。
4 免疫治疗的应用时机
ICIs 及相关联合治疗方法作为有效的新辅助治疗手段，可多方面、多阶段提高 HCC 患者临床获益。一项随机、开放标签、围手术期Ⅱ期研究（NCT03222076）[50]共纳入 27 例可手术切除 HCC 患者，在围手术期使用纳武利尤单抗联合或不联合伊匹单抗作为新辅助免疫治疗，术前免疫治疗后有 5 例（24%）达到完全病理缓解，有 3 例（16%）患者达到主要病理缓解，提示免疫治疗不局限于晚期 HCC，在可切除的早期 HCC 患者新辅助或辅助治疗中也能使用。有研究[51]报道，通过将不可切除 HCC 通过降期治疗转化为可切除 HCC，再二期切除术后 5 年生存率可达到 25%～57%，明显高于不可切除患者的 5 年生存率（6%～8%），且降低了肿瘤复发和改善了预后，而免疫治疗为晚期 HCC 转化为可切除提供了新的选择。2020 年 ASCO 年会公布的一项研究[52]结果表明，使用多靶点酪氨酸激酶抑制剂（阿帕替尼或仑伐替尼）联合 PD-1 单抗治疗 60 例晚期不可切除 HCC 患者，有 11 例（18.3%）患者被转化为可切除。以上研究结果提示，ICIs 治疗不仅显著延长晚期 HCC 患者的生存期和改善生活质量，也在早期新辅助治疗和晚期 HCC 的转化切除中显示出较大的应用价值。
5 小结与展望
以 ICIs 为代表的免疫治疗在 HCC 治疗中已取得了重大突破，寻求更有效且安全性良好的免疫联合方案是治疗晚期 HCC 未来的方向，但目前 ICIs 的临床应用仍存在亟待解决的问题[53]，如 HCC 存在明显的器官特异性免疫和高度免疫抑制型微环境；且通过驱动内源性免疫细胞的内源免疫疗法——ICIs 在很大程度依赖于已存在的 CTL，但 HCC 会通过多种抑制途径来消耗免疫细胞和逃逸免疫，导致 ICIs 的低应答率。因此，尚需更多研究以探索 HCC 患者反应的特异性生物标志物、老靶点新药物以及免疫联合治疗的最佳组合，揭示 ICIs 耐药以及发生免疫相关不良反应的机制，增强 ICIs 的疗效；同时鉴定新型免疫检查点及其与免疫细胞亚群所介导的新型免疫疗法以及如何进一步克服肿瘤微环境的阻碍也将为 HCC 患者提供更多选择。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：张子龙完成了文章撰写；黄孝伦教授指导写作思路、整体结构；石瑛、姚豫桐参与了编修。
原发性肝癌是全球高发肿瘤，在我国发病人数排名第 4 位，病死率高居第 2 位[1-2]。根据组织学类型，原发性肝癌可分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、胆管细胞癌和混合型肝癌，其中我国的原发性肝癌中 85%～90% 为 HCC[3]。HCC 的常见致病因素包括肝炎病毒感染、酒精、脂肪肝等，其常规治疗方式包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、经导管动脉化疗栓塞（TACE）、放疗等多种手段，这些治疗手段多在早期 HCC 患者中疗效较好，但对于晚期 HCC 患者疗效欠佳。21 世纪发展起来的分子靶向药物（如索拉非尼、仑伐替尼、阿西替尼等）虽能缓解肿瘤负荷、改善肿瘤相关症状，但对于提高患者总生存期及客观应答率的作用仍然有限[4]。基于对 HCC 发生发展分子机制的精准研究和肿瘤免疫治疗方法的快速发展，越来越多的晚期 HCC 患者开始从免疫治疗方法中获益。肿瘤免疫治疗是通过增强或恢复免疫系统的监视和杀伤能力，克服肿瘤逃避和抑制免疫反应的机制，纠正原有肿瘤微环境出现的免疫耐受、炎症免疫反应失衡等问题，从而杀伤肿瘤细胞[5]。根据不同的作用环节，免疫治疗策略可分为肿瘤疫苗、免疫检查点阻断治疗、过继细胞免疫治疗方法、非特异性免疫调节剂等[6]。在应用于 HCC 治疗的免疫治疗方案中，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗的疗效尤为显著，患者临床获益较高，但单一免疫治疗获益较少，临床应答率较低。有研究[7]显示，ICIs 联合靶向治疗如抗血管生成抑制剂方案（IMbrave150）能有效地克服耐药和提高疗效，已成为晚期 HCC 新的一线治疗方案。目前，有更多免疫联合治疗的临床研究也正在如火如荼地开展。笔者现对当前应用 ICIs 及其免疫联合治疗晚期 HCC 的研究现状及临床试验进展进行综述。
1 HCC 的免疫学特点
肝脏是一个免疫耐受性器官，为避免外源性肠道抗原经门静脉入肝后肝脏代谢作用引起过度免疫反应而形成了高度器官特异性免疫；由慢性肝炎和肝硬化发展形成的 HCC，其肝脏微环境改变和免疫细胞比例严重失衡[8-9]；此外，肝脏还存在多种免疫抑制机制和现象，如免疫抑制细胞群募集、自然杀伤（NK）细胞和 CD4+ T 细胞功能受损、抗原提呈缺陷及多个抑制性受体-配体通路的激活，进一步导致免疫耐受和免疫逃逸[10]。在免疫抑制细胞群中，调节性 T 细胞和髓样来源抑制细胞在血液循环和肿瘤内大量聚集，抑制效应性 CD4+、CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）的活化、增殖及其功能，降低 NK 细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒效应；另外，调节性树突状细胞通过高分泌白介素-10 和吲哚胺 2,3-双加氧酶来抑制 T 细胞活化[11]；同时 HCC 通过低表达共刺激分子（如 B7-1、B7-2）以及高表达主要组织相容性复合物Ⅱ类分子和免疫检查点分子，使得肿瘤特异性 T 细胞因缺乏共刺激信号而无法活化、增殖，并通过下调或不表达 Fas 蛋白而逃避自身凋亡[12]。总之，HCC 通过抑制机体免疫功能以及调控自身分子表达来逃逸机体免疫监视，形成高度免疫抑制型微环境，从而使传统放化疗和分子靶向药物的疗效受限。
2 ICIs
免疫检查点是在免疫细胞上表达、T 细胞抗原受体识别抗原启动阶段的抑制信号分子，在防止 T 细胞过度激活导致的炎症组织损伤和维持自身免疫中起保护作用。ICIs 治疗是利用靶向免疫检查点分子的特异性单克隆抗体（简称“单抗”）或抑制剂消除免疫抑制信号并释放免疫系统“刹车”，从而增强内源性抗肿瘤免疫应答[13-14]。免疫检查点分子主要包括程序性死亡受体 1（PD-1）及其配体 1（PD-L1）、CTL 相关蛋白 4（CTLA-4）、T 细胞免疫球蛋白-3、淋巴细胞活化基因-3 等，其中靶向结合 PD-1、PD-L1 和 CTLA-4 单抗已成为目前 HCC 免疫治疗的重要选择；另一方面，基于免疫检查点的免疫抑制原理，通过检测关键分子的基线表达水平可预测 ICIs 治疗 HCC 的疗效，也可用于筛选 ICIs 治疗获益优势人群。既往研究[15]表明，肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、PD-L1 表达水平、肿瘤浸润性淋巴细胞、T 细胞受体克隆性、基因表达特征等与 ICIs 的疗效有关。例如，在黑色素瘤、结肠癌、非小细胞肺癌患者中，高肿瘤突变负荷或微卫星不稳定性患者接受 ICIs 治疗的响应率高且预后较好，但在 HCC 患者中尚不明确[16-17]。因此，尚需更多研究来明确 HCC 组织和血清免疫检查点分子的临床指示意义，确定与疾病缓解或预后相关的生物标志物，以优化在 HCC 患者中基于 ICIs 的精准治疗策略，提升患者的临床获益。以下对于主要的 ICIs 以及免疫联合治疗方案进行详细介绍，ICIs 及免疫联合治疗用于 HCC 患者的主要临床试验见表 1。
表1
ICIs 治疗和免疫联合治疗 HCC 的主要临床研究结果
2.1 PD-1 单抗
PD-1 是 CD28 家族成员，多表达于活化的 T 细胞、B 细胞和髓系细胞上，对免疫系统起负性调节作用；PD-L1 在正常外周组织和活化的免疫细胞均有组成性表达[18]，而肿瘤细胞表面高表达 PD-L1 分子能与 T 细胞的受体 PD-1 结合，使 T 细胞未能激活和增殖，以致肿瘤细胞能逃逸免疫监视和特异性杀伤效应[19]。PD-1/PD-L1 单抗可靶点阻断 PD-L1 蛋白与 PD-1 受体结合，恢复免疫识别和杀伤，使 T 细胞正常发挥抗肿瘤免疫应答作用[20]。目前美国食品和药物管理局（FDA）已批准两种 PD-1 单抗即纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）治疗既往索拉非尼治疗后进展或无法耐受索拉非尼的晚期 HCC 患者[21-22]。
Ⅰ/Ⅱ期多中心开放式非对照临床试验 CheckMate040（NCT01658878）[21]结果表明，纳武利尤单抗治疗既往索拉非尼治疗后进展的晚期 HCC 患者，客观应答率可达 20%，包括 2 次完全应答和 64% 的疾病稳定率，且中位总生存期达到 15.6 个月，其中 HCC 组织免疫组织化学 PD-L1 阳性和阴性患者客观应答率分别为 27.7% 和 15.7%，总生存期分别为 28.1 个月和 16.6 个月，且均获得临床缓解。基于这些结果，FDA 迅速批准了纳武利尤单抗用于晚期 HCC 二线治疗，同时也表明 PD-L1 是预测抗 PD-1 疗效的可行标志物，但尚未作为临床指导用药的依据。来自德国 3 个中心的回顾性临床研究[23]分析 34 例晚期 HCC 患者接受纳武利尤单抗治疗后，4 例（11.8%）部分缓解，8 例（23.5%）病情稳定，初步验证了其疗效和安全性。然而在 2019 年欧洲肿瘤内科学会年会（ESMO）报告纳武利尤单抗一线治疗晚期 HCC 患者的Ⅲ期临床试验 CheckMate459（NCT02576509）[24]结果，相比于索拉非尼，纳武利尤单抗未达到预先指定的延长总生存期、提高耐受性的主要终点，但确有临床意义的总生存率、客观缓解率和完全缓解率的显著改善，进一步说明纳武利尤单抗相比索拉菲尼治疗晚期 HCC 在疗效和安全性上更优。
同样，Ⅱ期临床试验 Keynote224（NCT02702414）[22]表明，帕博利珠单抗用于治疗晚期 HCC 患者具有较好的临床疗效和安全性，因此 FDA 随后也批准了帕博利珠单抗用于晚期 HCC 的二线治疗。然而在帕博利珠单抗联合最佳支持治疗对比安慰剂联合最佳支持治疗的Ⅲ期临床试验 Keynote240（NCT02702401）[25]中，相比对照组，帕博利珠单抗组未达到预定的统计学阈值，但患者总生存期和无进展生存期均有明显改善，死亡和进展风险均下降 22%，帕博利珠单抗的疗效得到进一步验证。目前我国也正在开展采用帕博利珠单抗二线治疗接受过系统治疗的晚期 HCC 患者的Ⅲ期临床试验研究 Keynote-394，该药治疗我国肝癌患者的疗效评估结果值得期待。
另一人源化 PD-1 单抗，卡瑞利珠单抗（camrelizumab），早在 2018 年 ESMO 年会即有报告其二线治疗我国晚期 HCC 患者的临床疗效，治疗组表现出较高的客观应答率、持久的免疫反应和可接受的不良反应[26]。因其良好临床疗效[27]而被我国国家药品监督管理局批准用于接受过索拉非尼治疗或含奥沙利铂系统化疗的晚期 HCC 患者的治疗，成为我国首个被批准治疗晚期 HCC 患者的 PD-1 单抗。
在最新 2020 年中国临床肿瘤学会（CSCO）肝癌指南的二线治疗中将上述 3 种 PD-1 单抗提升到Ⅰ级推荐（2A 级证据）。
2.2 PD-L1 单抗
目前 PD-L1 单抗正处于晚期 HCC 临床试验的评估阶段，包括阿韦单抗（avelumab）、度伐利尤单抗（durvalumab）和阿特珠单抗（atezolizumab）。阿韦单抗治疗晚期 HCC 患者的疗效正在Ⅱ期研究（NCT03389126）中进行评估。度伐利尤单抗已在早期Ⅱ期临床研究（NCT01693562）[28]中报道治疗晚期 HCC 患者疗效和安全性较好。阿特珠单抗已被用于非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌免疫治疗，而关于 HCC 研究更多集中在对其联合治疗疗效评估，并在与抗血管抑制剂联合治疗中表现优异。因此可见，PD-1/PD-L1 单抗均能显著延长晚期 HCC 患者总生存期，减少治疗相关不良反应并改善预后。
2.3 CTLA-4 单抗
CTLA-4 是 T 细胞表达的白细胞分化抗原，CTLA-4 与 CD28 分子竞争结合抗原提呈细胞表面配体 CD80/CD86，启动抑制性信号，从而限制 T 细胞的激活和增殖[29]。CTLA-4 单抗是通过阻断 CTLA-4 与其配体结合来刺激 T 细胞活化、增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。CTLA-4 单抗是最早应用于临床的 ICIs。2011 年 FDA 批准上市了第一个靶向 CTLA-4 人源化单抗伊匹单抗（ipilimumab）用于治疗晚期黑色素瘤患者[30]。另一个 CTLA-4 单抗曲美单抗（tremelimumab）正处于晚期黑色素瘤、肝癌以及结直肠癌的临床试验并被 FDA 授予了治疗 HCC 的孤儿药资格。在一项Ⅱ期临床试验（NCT01008358）中，17 例既往索拉非尼治疗后进展、与丙型肝炎病毒相关 HCC 患者接受曲美单抗治疗后，患者的客观应答率和疾病稳定率分别为 17.6% 和 76.4%，疾病进展的中位时间为 6.48 个月，而 3/4 级不良反应发生率为 45%[31]。曲美单抗有良好的治疗潜力，但同时也需要进一步探索预测免疫反应的生物标志物和潜在的联合治疗策略，以克服 ICIs 治疗中较高的不良反应发生率和低应答率（10%～20%）的问题。
3 免疫联合治疗
3.1 双 ICIs 联合治疗
临床前研究[37-38]数据表明，PD-1/PD-L1 单抗与 CTLA-4 单抗联合治疗具有协同抗肿瘤活性，并在纳武利尤单抗与伊匹单抗联合治疗晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验[39]中得到验证。一项旨在研究度伐利尤单抗联合曲美单抗治疗晚期 HCC 患者的 I / II 期临床试验（NCT02519348）[32]正在进行中，基于 40 例病例的初步研究结果显示客观应答率为 15%，疾病稳定率为 57.5%。2019 年美国临床肿瘤协会（ASCO）年会的一项报告[33]表明，纳武利尤单抗与伊匹单抗联合治疗 148 例晚期 HCC 患者结果，客观应答率为 31%，有 7 例（5%）完全应答，更加验证了双免联合治疗的优越性，基于此结果，FDA 加速审批了纳武利尤单抗（O 药）+伊匹单抗（Y 药）双免方案为首个唯一用于 HCC 二线治疗的双免疗法。
3.2 ICIs 联合抗血管生成抑制剂
肿瘤的生长会加快血管异生，进而导致肿瘤微环境中血管渗漏、缺氧和多条免疫抑制通路的激活。血管内皮生长因子（VEGF）是促进肿瘤血管生成的重要因子，抗血管生成抑制剂可通过抑制 VEGF 诱导肿瘤血管的正常化，重塑肿瘤微环境来减少免疫抑制途径[40]。临床前研究[41]表明，这种联合疗法可促进抗原提呈细胞的成熟和 CTL 的活化和浸润，减少肿瘤组织中髓样来源的抑制细胞和调节性 T 细胞的浸润，可协同促进对肿瘤的清除作用。贝伐单抗（bevacizumab）是人源化抗 VEGF 的单抗，在Ⅰb 期研究（NCT02715531）[34]中，研究者将阿特珠单抗单一疗法和阿特珠单抗联合贝伐单抗疗法治疗晚期 HCC 患者的疗效和安全性进行对比，发现联合治疗能显著提高患者总生存期和应答率。最新公布的Ⅲ期临床试验 IMbrave150（NCT03434379）[7]研究结果表明，阿特珠单抗联合贝伐单抗相比索拉非尼治疗共 501 例转移或无法切除的晚期 HCC 患者，联合治疗方案使患者死亡风险相对下降了 42%，12 个月生存率提高到 67.2%，显著延长患者的总生存时间和无瘤生存时间。该类联合方案突破了不可切除 HCC 患者生存瓶颈，并被 FDA 批准用于治疗既往未接受过系统治疗的不可切除 HCC 患者，成为首个获批的肝癌一线免疫疗法。同时期我国开展的一项Ⅰb 期临床研究（NCT04072679）[42]共纳入 50 例晚期 HCC 患者，分别接受低剂量和高剂量 PD-1 单抗信迪利单抗联合贝伐珠单抗生物类似药 IBI305 治疗后，高剂量组客观应答率高达 33.3%，疾病稳定率高达 83.3%，更加验证了此类联合治疗的疗效和安全性较好。在美国国立综合癌症网络（NCCN）和 CSCO 最新发布的肝癌指南的一线治疗中都将此联合方案推荐为Ⅰ级（1A 类证据）。
3.3 ICIs 联合多靶点酪氨酸激酶抑制剂
多靶点酪氨酸激酶抑制剂（如索拉非尼、仑伐替尼）是可抑制蛋白酪氨酸激酶介导的多个信号传导通路，抑制肿瘤细胞的增殖，阻断新生血管生成，同时具有免疫调节作用（如减少髓样来源的抑制细胞和调节性 T 细胞，增强 NK 细胞和 T 细胞的肿瘤浸润和活化）的抗肿瘤药物。2019 年 ASCO 年会公布了阿特珠单抗联合阿西替尼治疗晚期 HCC 的临床数据，结果显示客观应答率为 13.6%，中位无进展生存时间可达 5.5 个月，但联合治疗加重了单药治疗的毒性，3/4 级治疗相关不良反应率为 72.7%[35]。提示联合治疗方案效果显著，但联合用药的剂量、周期仍需探索。另外，还有两项临床试验[43-44]COSMIC-312 试验（NCT03755791）中的阿特珠单抗联合卡博替尼疗法和 LEAP-002 试验（NCT03713593）中的帕博利珠单抗联合仑伐替尼疗法正在评估这类联合治疗的疗效和安全性。NCCN 指南基于 REFLECT 试验结果[45]将仑伐替尼一线治疗推荐等级由 2A 类上升为 1 类。在 CSCO 肝癌指南一线治疗Ⅲ级推荐中新增帕博利珠单抗联合仑伐替尼、卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼/奥沙利铂为主的系统化疗。
3.4 ICIs 联合其他治疗
化疗、放疗、介入治疗等可通过杀死肿瘤细胞后释放肿瘤抗原，如基于奥沙利铂的化疗（如 FOLFOX4、GEMOX 方案）可诱导免疫原性细胞死亡[46]，联用 ICIs 可以进一步维持或增强抗原提呈细胞激活 T 细胞的功能，从而促进肿瘤特异性免疫反应。目前一项比较卡瑞利珠单抗联合 FOLFOX4 方案与 FOLFOX4 方案或索拉非尼一线治疗晚期 HCC 疗效的Ⅱ期临床试验（NCT03092895）正在评估中，基于 34 例病例结果[36]显示，客观应答率和疾病稳定率分别为 26.5%、79.8%，中位无瘤生存时间可达 5.5 个月，中位总生存时间尚未达到，3 级以上免疫相关不良反应发生率仅为 5.9%，提示这类联合治疗方法的疗效和安全性可观。在 CSCO 指南二线治疗中将“既往使用过索拉菲尼患者可考虑卡瑞利珠单抗联合 FOLFOX4 方案”列为Ⅱ级推荐。在一项回顾性临床病例分析中，5 例晚期 HCC 患者接受立体定向放疗联合纳武利尤单抗治疗后，2 例完全缓解，3 例部分缓解，中位无进展生存时间可达 14.9 个月，1 年内均达到局部控制和存活[47]；另一项研究[48]报道选择性内放疗能增强 HCC 患者免疫细胞激活和募集，特别是表达 PD-1 的免疫细胞。以上两项研究均提示放疗与 ICIs 联合治疗具有协同作用，但缺乏前瞻性临床研究验证。在一项 TACE、射频消融或冷消融联合曲美单抗治疗晚期 HCC 患者的早期临床试验中，患者中位疾病进展时间为 7.4 个月，中位总生存时间为 12.3 个月，验证了这类联合治疗的可行性，但仍需进一步明确其疗效和安全性。一项临床试验 NCT03397654[49]正在评估帕博利珠单抗联合 TACE 治疗晚期 HCC 患者的有效性和安全性。因此，免疫治疗联合局部治疗是实现 HCC 患者的精准个体化治疗的重要方向。
4 免疫治疗的应用时机
ICIs 及相关联合治疗方法作为有效的新辅助治疗手段，可多方面、多阶段提高 HCC 患者临床获益。一项随机、开放标签、围手术期Ⅱ期研究（NCT03222076）[50]共纳入 27 例可手术切除 HCC 患者，在围手术期使用纳武利尤单抗联合或不联合伊匹单抗作为新辅助免疫治疗，术前免疫治疗后有 5 例（24%）达到完全病理缓解，有 3 例（16%）患者达到主要病理缓解，提示免疫治疗不局限于晚期 HCC，在可切除的早期 HCC 患者新辅助或辅助治疗中也能使用。有研究[51]报道，通过将不可切除 HCC 通过降期治疗转化为可切除 HCC，再二期切除术后 5 年生存率可达到 25%～57%，明显高于不可切除患者的 5 年生存率（6%～8%），且降低了肿瘤复发和改善了预后，而免疫治疗为晚期 HCC 转化为可切除提供了新的选择。2020 年 ASCO 年会公布的一项研究[52]结果表明，使用多靶点酪氨酸激酶抑制剂（阿帕替尼或仑伐替尼）联合 PD-1 单抗治疗 60 例晚期不可切除 HCC 患者，有 11 例（18.3%）患者被转化为可切除。以上研究结果提示，ICIs 治疗不仅显著延长晚期 HCC 患者的生存期和改善生活质量，也在早期新辅助治疗和晚期 HCC 的转化切除中显示出较大的应用价值。
5 小结与展望
以 ICIs 为代表的免疫治疗在 HCC 治疗中已取得了重大突破，寻求更有效且安全性良好的免疫联合方案是治疗晚期 HCC 未来的方向，但目前 ICIs 的临床应用仍存在亟待解决的问题[53]，如 HCC 存在明显的器官特异性免疫和高度免疫抑制型微环境；且通过驱动内源性免疫细胞的内源免疫疗法——ICIs 在很大程度依赖于已存在的 CTL，但 HCC 会通过多种抑制途径来消耗免疫细胞和逃逸免疫，导致 ICIs 的低应答率。因此，尚需更多研究以探索 HCC 患者反应的特异性生物标志物、老靶点新药物以及免疫联合治疗的最佳组合，揭示 ICIs 耐药以及发生免疫相关不良反应的机制，增强 ICIs 的疗效；同时鉴定新型免疫检查点及其与免疫细胞亚群所介导的新型免疫疗法以及如何进一步克服肿瘤微环境的阻碍也将为 HCC 患者提供更多选择。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：张子龙完成了文章撰写；黄孝伦教授指导写作思路、整体结构；石瑛、姚豫桐参与了编修。
